锁定"毒源"的利器：基因组时代的病原检测技术（一）

　出品：新浪科技《科学大家》、未来论坛

　　主讲嘉宾：王健伟，中国医学科学院-北京协和医学院副院校长

　　经过一整年严格的新冠疫情防控，时间再次带着我们进入严冬，全国多个城市又出现了小范围疫情。与去年此时不同的是，我们已经掌握了更多的防控信息和技术，也有了一套较为成熟的应对方案，包括北京、大连、沈阳等城市在内，各地均能够在发现疫情后短时间内完成流调排查，为数千万市民进行病毒核酸检测。

　　新型冠状病毒的全球大流行是很多人第一次亲身经历重大疫情。其实自人类文明诞生以来，传染病就如影随形，和人类相伴。人类历史上数次爆发重大疫情，瘟疫造成的死亡数量堪比战争。传染病不仅危害人类的健康，还对政治、经济、社会、军事产生重要的影响。从希腊文明的陨落到基督教的兴起，从阿兹特克帝国的衰亡到第一次世界大战的终战，其间都有传染病的身影。

　　尽管随着现代医学的发展，传染病的发病率和病死率有了显著的下降，但仍然是人类的重大挑战。比尔盖茨在2015年的一次演讲时说道：“在未来几十年，如果说有什么东西能够杀死上千万人，最有可能是一种高度传染性的病毒。”鉴于此，世界卫生组织号召全世界加强对传染病的研究，以应对可能出现的暴发流行。严格准确的病原检测技术，正是重要的应对手段之一。检测技术如何帮助防疫人员们变身“福尔摩斯”？病毒溯源的过程又是什么样的？

　　未雨绸缪的前瞻性研究

　　从2015年开始，世界卫生组织每年都列出号召全球优先研究的传染病清单。从2018年开始，“X疾病”一次开始出现在这份清单中。“X疾病”代表一种未知病原体造成的严重的流行病，可以是自然发生的，也可以是人为故意的，有可能在任何的时间，由多种来源触发，或许会夺去数百万人的生命。这种“X疾病”代表了未来的一种可能——可能是一种未知的传染病。

　　目前，已经知道的病毒有很多。据科学家估计，在哺乳动物和鸟类当中有100多万种病毒，而其中至少有60万种以上可以感染人类。但目前已知可感染人类的病毒还不到300种，“尽管大家知道病毒是潜在的威胁，但依然无法预测下一种新的病毒在何时何地出现，或者来自哪一种物种。”因此，加强病原检测鉴定技术以及药物疫苗的研究，是应对未来可能出现的新发突发传染病挑战的一项重要举措，这其中病原检测技术又首当其冲。

　　目前病原的检测技术面临着众多的挑战。一是病原的种类非常多。目前可以引起传染病的病原包括病毒、细菌、真菌、寄生虫等很多种类。二是病原体的变异非常频繁，可以通过突变来逃逸免疫，引起新的流行，也可以逃避原有疫苗的作用。动物来源的病原识别也比较困难。三是可能存在着多种病原体共感染的现象，为病原的鉴定带来了困难。此外，临床样本中病原的含量可能比较低，检测也比较困难。

　　近百年以来，随着微生物学的发展，对病原体的检测已经建立了多种方法。以病毒检测为例，我们可以检测分离的整体病毒颗粒，也可以对其抗原成份进行检测，还可以检测病毒感染人体产生的抗体，对病毒的感染进行诊断。另外，随着分子生物学技术的兴起，核酸检测成为代表性的技术方法。这些技术的用途比较广泛，但是还存在一些不足。比如病毒颗粒分离培养的方法，它的技术难度比较大、比较耗时，检出率低，难以普及。抗原抗体的检测方法容易受到干扰，抗体的检测存在窗口期的问题，抗原的检测存在灵敏度的问题。

　　核酸检测是目前应用比较广泛的，最具代表性的是PCR方法。这种方法通过对一个病毒的基因片段进行上亿次的扩增，使痕量的病毒核酸得以检测，所以在临床上得到了比较多的应用。但PCR的方法受制于对病毒序列的依赖，即必须先要知道病毒的基因序列才能设计出PCR的检测方法。

　　“一锤定音”：宏基因组测序技术

　　近年来，高通量的宏基因组测序技术逐渐得到了应用，并且发挥了重要的作用，特别是在病原体的诊断当中，发挥“一锤定音”的作用。宏基因组技术用于病原体的检测有很多的优势。一是和PCR这些序列依赖的方法相比，它是非序列依赖性的，所以不需要预知任何病原体序列信息就可以进行检测。二是病原体检测的灵敏度比较高。三是检测的通量高，可以同时检测上万种病原微生物的物种，也可以发现可能的共感染。四是检测效能高，通过一次测序就可以拼接出病原体的基因组序列，不需要再重复进行实验。五是解析的深度深，可以同时分析病原体的变异和耐药等情况。最后，它获取的信息全，除了获取病原的序列之外，还可以同时获取宿主的基因组和转录组的信息，为预警和临床诊疗提供基础。

　　宏基因组的病原体检测技术在近十几年以来，在新病原的发现当中发挥了重要的作用。首先就是新冠病毒的发现和确症。2019年12月，武汉出现了不明原因的肺炎。由于偶然的机会，我们的合作伙伴对来自武汉的一例不明原因肺炎的肺泡灌洗液的样本进行了深入的测序，对这个数据分析后我们发现里面存在着一种新的冠状病毒，并且拼接出了它的全基因组序列。这个序列显示，它和既有的SARS病毒和MERS病毒（中东呼吸综合症冠状病毒），序列是完全不同的。这说明存在一种全新的冠状病毒，可能和出现的肺炎病例有关系。

　　接下来要做的是确证是不是这一新的冠状病毒引起了这些肺炎的病例。所以我们从病人身上收集了更多肺泡灌洗液、咽拭子、痰液等样本，把呼吸道样本进行前处理，提取核酸之后来建立测序文库。对样本上机测序之后进行生物信息学的分析，首先去除人类基因组的污染，把剩余的序列和公开的数据进行比对，鉴别里面存在的微生物的物种，从而确定病原。

　　但是对于新病原的鉴定来讲，光靠测序还不够，还需要用其他的方法进行鉴定。我们首先对5例样本进行检测。可以看到，5个病例的呼吸道样本当中都可以检测出一种新的冠状病毒的基因。对它进行基因谱系的分析，就像画家谱一样的，和其他已经知道的冠状病毒去比较发现，发现这个冠状病毒是一个全新的病毒。而且我们也推测，它和SRAS病毒相似，也可能使用ACE2作为受体。

　　在这个基础上，我们很快分离出了病毒，通过电子显微镜可以看出，它是典型的冠状病毒的形态，上面有像皇冠一样的特征性结构。另外，我们也做了免疫学的实验。因为病人感染病毒之后会产生抗体，我们利用这些抗体与分离的病毒做免疫荧光可以看到阳性的信号。所以结合我们的宏基因组的分析、PCR的检测、病毒的分离、免疫荧光的鉴定等等，提示这是一种新的冠状病毒，引起了不明原因的肺炎。

　　因为有了这样的方法，我们和曹彬教授、黄朝林教授等合作，很快对早期的病例进行诊断，使我们能够很快报道这些病例的临床特征，而且也对这些病例的来源进行了追溯，为疫情的预警和临床诊疗方案的制定提供了重要的基础。我们也通过GISAID的平台，代表国家最早向全球共享了病毒全基因组的序列。病原鉴定工作得到了世界卫生组织的高度评价，谭德赛总干事指出：“中国在创记录的时间内识别出病原体，并立即进行分享，为迅速研发诊断工具作出了贡献。”

　　在这个基础上，我们也研发了病毒核酸的检测方法，向全国推广应用。2020年1月11日，这一方法在武汉现场通过了国家卫生健康委科教司组织的验证，之后获得了产品证书。

　　另外，针对PCR检测方法对咽拭子检出率不到50%的情况，我们也提出结合IgM抗体的检测，可以大幅提升病毒感染的诊断率，我们也获得了两项诊断产品的证书。